2024年11月22日，《Nature Methods》期刊在線發表了題為《Super-resolution imaging of fast morphological dynamics of neurons in behaving animals》的研究論文。該研究由中國科學院腦科學與智能技術卓越創新中心(神經科學研究所)王凱研究組完成。研究團隊開發了一種新型超分辨顯微成像技術，有效解決了背景噪聲干擾和運動偽影兩大技術難題，可在清醒動物腦中對神經元的快速動態進行超分辨率光學成像和解析，為研究動物學習過程中的神經元突觸可塑性基礎提供了有力的新工具。
 

　　理解微觀生命過程如何有機構成宏觀生命體，并實現復雜的生理功能，是生命科學的重要研究內容。然而，受限于研究技術手段，微觀動態的研究通常需要在簡化的離體實驗中開展，使其難以與宏觀生命現象如動物的睡眠和學習行為等直接建立聯系。在神經科學研究中，解析突觸的形態和功能可塑性是探究學習記憶底層機理，進而理解大腦工作原理的重要基礎。神經元突觸是神經網絡連接的關鍵結構。在學習記憶等過程中，神經網絡連接權重的改變和突觸形態的變化高度相關。使用活體動物雙光子顯微成像技術捕捉突觸在學習記憶、睡眠和疾病等過程中的形成和消亡，極大提升了對神經元形態可塑性和腦功能之間聯系的認識。然而，受限于光學衍射效應，傳統光學顯微鏡，包括雙光子顯微鏡，無法突破200~300納米的分辨率極限，難以進一步觀察研究更精細的結構和動態。近年來，新發展的超分辨光學顯微成像技術可突破光學衍射極限，并已經為突觸研究帶來了一場技術革命。然而，由于面臨多項技術難點，目前超分辨率熒光顯微鏡多應用于離體的細胞和腦片研究，尚未有技術能夠在清醒動物中超分辨解析正常生理和行為狀態下突觸的結構和功能。因此，開發能夠應用于清醒動物的超分辨光學成像新技術一直是神經科學和光學成像技術領域的長期愿景和技術前沿。
 

　　發展可應用于清醒動物的超分辨成像技術面臨兩個主要的技術難題，背景噪聲干擾和運動偽影。單分子定位(PALMSTORM)和結構光照明(SIM)超分辨成像技術基于寬場成像，受背景噪聲干擾嚴重。同時，這些技術需要樣品在保持靜止的狀態下采集多張圖片來重構一張超分辨圖片，難以容忍動物呼吸和心跳造成的微小移動。受激發射損耗顯微鏡(STED)基于點掃描成像，可通過共聚焦機制濾除背景噪聲干擾，但其需要較長的信號積累時間，受運動偽影干擾嚴重，只嘗試在麻醉動物中開展小視場成像。為了同時解決這些技術難題，研究團隊創新提出了多模式復用結構光線照明超分辨顯微成像技術(MLS-SIM)。該技術的關鍵創新在于提出了在單次線掃描成像過程中，通過快速切換不同的線照明模式來分別獲得三個方向上的超分辨信息，并提出新的超分辨重構理論框架，實現準確高效的超分辨圖像重構。在線性熒光激發模式下，MLS-SIM可以150納米橫向分辨率對清醒小鼠皮層中神經元樹突棘尖刺和軸突終扣微觀動態開展長達上千幀的連續成像，速度達每秒數幀，可容忍每秒50微米的樣品運動而不影響其超分辨成像性能。進一步，利用皮秒脈沖激光實現非線性熒光激發，非線性MLS-SIM可以將橫向分辨率提高至約100納米，且保持同樣的樣品運動容忍度。
 

　　多模式復用結構光線照明超分辨顯微成像技術填補了超分辨顯微鏡在清醒動物上開展成像的空白，并彌補了以往技術在活體動物成像時長和光漂白特性上的不足，為在體微觀研究提供了廣闊的前景。利用該技術，研究團隊在清醒的小鼠大腦中驗證了神經元樹突棘和軸突終扣上存在著快速變化的尖刺動態，并量化研究了清醒-睡眠循環中神經元的微觀快速動態的改變。該技術還實現了雙色超分辨同時成像，探究了PSD-95蛋白聚團的微觀結構與樹突棘發生之間的聯系。在雙色成像實驗中，研究團隊發現了樹突主干上存在許多動態的小突起，這種突起結構的尺寸大多小于傳統雙光子成像技術的解析能力，只能通過超分辨成像進行動態分析。動態觀察顯示，樹突主干上的PSD-95聚團附近存在著頻繁的小突起生成現象。通過對一段時間內的動態進行統計分析，研究團隊發現樹突主干上的PSD-95聚團和主干上的小突起存在著顯著的共定位現象。這一新發現的小突起結構及其與PSD-95的共定位可能暗含樹突棘發生的細胞機制，為未來的突觸可塑性研究提供了新的證據。
 

　　總結而言，該研究開發了一種新型超分辨成像技術，同時解決了背景噪聲干擾和運動偽影兩大技術難題，填補了在清醒動物中開展超分辨成像的技術空白。該技術的出現使得在清醒動物生理狀態下對神經元及其他細胞的亞細胞微觀動態進行長時間、大范圍的成像和分析成為可能。這一關鍵技術進步為超分辨成像在神經科學領域的廣泛應用奠定了基礎，為神經科學研究提供了新的有力工具。
 

　　中國科學院腦科學與智能技術卓越創新中心(神經科學研究所)的博士畢業生張宇杰為該研究的第一作者，白璐，王鑫，趙鈺琛，張田蕾和葉立晨參與了課題的研究，腦智卓越中心張哲研究員、杜旭飛博士和杜久林研究員參與指導了該項工作，王凱研究員為本論文的通訊作者。這項研究得到了科技部、國家自然科學基金委、上海市及中國博士后科學基金的經費資助。
 

　　多模式復用結構光線照明超分辨顯微成像技術MLS-SIM應用于清醒小鼠皮層超分辨成像

 

　　圖注(a)MLS-SIM照明范式示意圖。(b)清醒小鼠腦皮層神經元形態的超分辨成像結果。LC：線共聚焦成像；LCDeconv：經過反卷積處理的線共聚焦成像；MLS-SIM：超分辨成像。標尺，5微米。(c)小鼠腦皮層不同深度成像的結果。標尺，2微米。(d)超分辨觀察到樹突棘尖刺的快速和長時程動態。標尺，1微米。(e)雙色成像樹突棘形態和PSD-95蛋白。紫色：膜標記mRuby；綠色：EGFP標記的PSD-95。標尺，500納米。