細胞是生命活動的基本單位。每時每刻，人體內都在上演著大量不同類型細胞間交互作用所形成的交響曲。然而，在這一連接微觀與宏觀之間的介觀尺度上，卻存在巨大的技術空白，使得當前研究難以在哺乳動物的活體環境器官尺度下同時觀測大量細胞在不同生理與病理狀態下的時空異質性，極大限制了腦科學、免疫學、腫瘤學、藥學等學科發展。僅以腦科學為例，大量神經元間的相互連接和作用涌現出如智能、意識等功能，厘清神經環路的結構和活動規律是解析大腦工作原理的必由之路。然而具備單神經元識別能力的傳統顯微鏡往往只具備毫米級視場，僅能覆蓋小鼠單個或幾個腦區實現單個平面的神經信號動態記錄；功能核磁雖然能夠實現三維全腦范圍觀測，但空間分辨率卻遠不足以識別單細胞。因此，2013年啟動的美國腦計劃也將“大規模神經網絡記錄技術”列為九大資助領域之一。同樣，對于腫瘤學而言，只有兼具大視場與高分辨才能全景式捕捉腫瘤發生發展的完整過程，從而更精準地研究不同藥物反應，發現新的藥物靶點。
 

　　瞄準這一國際前沿難題，清華大學戴瓊海院士團隊早在2013年就獲得了國家自然科學基金委重大科研儀器研制項目支持，在國際上率先開展了介觀活體顯微成像領域研究，并于2018年成功研制了國際首臺億像素介觀熒光顯微儀器RUSH，能夠同時兼具厘米級視場與亞細胞分辨率。盡管這一系統被國際同行譽為介觀顯微成像領域的先驅，但是由于儀器復雜昂貴，在當時僅能被少數科學家使用。與此同時，RUSH系統仍然面臨一系列瓶頸，包括：如何利用二維傳感器實現高速三維成像；如何避免激光長時間照射所引起的細胞損傷(即光毒性)從而實現長時程高速觀測；如何克服復雜成像環境導致的光學像差與背景干擾；如何提升弱光條件下的成像信噪比；如何高效處理大規模介觀數據等等。每一項技術瓶頸本身都是生物醫學成像領域的國際難題，而如何在同一系統上同時解決這些活體成像壁壘，則變得更為挑戰。
 

　　此后六年間，戴瓊海院士帶領成像與智能技術實驗室，瞄準活體介觀顯微成像高峰，持續攻關這些國際前沿難題，先后提出掃描光場成像原理、數字自適應光學架構、虛擬掃描算法、共聚焦掃描光場架構、自監督去噪算法等關鍵理論與技術，相關成果均發表于《細胞》(Cell)、《自然》(Nature)、《自然·生物技術》(Nature Biotechnology)、《自然·方法》(Nature Methods)等國際期刊，逐一解決了介觀活體顯微成像中一系列壁壘，為新一代介觀活體顯微儀器奠定了基礎。
 

圖1.活體介觀成像的技術空白
 

　　9月13日，清華大學戴瓊海院士團隊在《細胞》(Cell)發表最新工作：長時程活體介觀成像完整記錄哺乳動物器官尺度的三維細胞交互行為(Long-term mesoscale imaging of 3D intercellular dynamics across a mammalian organ)，宣布了新一代介觀活體顯微儀器RUSH3D系統的問世，在兼具厘米級三維視場與亞細胞分辨率的同時，RUSH3D能以20Hz的高速三維成像速度實現長達數十小時的連續低光毒性觀測。相比當前市場上最先進的商業化熒光顯微鏡，其在同樣分辨率下的成像視場面積提升近百倍，三維成像速度提升數十倍，光毒性降低上百倍(有效觀測時長提升百倍)。這一前所未有的跨空間和時間的多尺度成像能力，為復雜生物過程研究提供了全新視角。區別于傳統光學顯微鏡聚焦于單個細胞內的物質交互過程，RUSH3D使得研究人員可以首次以全景方式動態觀測哺乳動物器官尺度細胞精度的組織異質性，在活體組織中原位研究大規模多樣化細胞在完整生理與病理過程中的動態交互行為。
 

　　交叉研究團隊利用RUSH3D在腦科學、免疫學、醫學與藥學等多學科展示了令人矚目的成果。首次在活體小鼠上以單細胞分辨率實現了覆蓋大腦皮層2/3層的高速長時程三維觀測，捕捉了多感官刺激下皮層各腦區的各異性響應模式，能夠連續多天以單神經元精度追蹤大規模神經響應。首次觀測到了急性腦損傷后多腦區的免疫反應，發現大量中性粒細胞從非血管區域往腦內的遷移與回流過程。首次在小鼠免疫反應過程中同時觀測到了淋巴結內多個生發中心的形成過程，以及T細胞在不同生發中心之間的遷移現象。這些初步實驗雖然僅僅展現了RUSH3D應用的冰山一角，但充分展示了其為神經科學、免疫學、腫瘤學、藥學等領域前沿研究所帶來的廣闊應用前景。該儀器的研制與產業化填補了對復雜生命現象介觀尺度活體觀測的空白，標志著我國在活體介觀顯微成像領域持續引領國際發展，極大提升了我國高端科研儀器的研究和應用水平，更為人類探索生命奧秘打開了新的維度，為揭示神經、腫瘤、免疫新現象和新機理提供了新的殺手锏，使得我國生命科學家、醫學家能夠率先使用我國自主高端儀器設備來解決重大基礎研究問題。
 

圖2.RUSH3D系統圖
 

　　計算成像是改變了傳統光學成像“所見即所得”的設計理念。利用計算編碼、計算采集等多維尺度計算架構，實現對高維光場的超精細感知與融合，為機器設計更好的感知系統，從而突破傳統光學成像的一系列物理瓶頸。然而這條創新之路同樣充滿荊棘，RUSH3D系統集成了團隊過去十多年來一系列的理論和關鍵技術創新，才真正實現了整體性能的顛覆性提升。針對二維傳感器難以捕捉三維動態變化的難題，團隊提出了掃描光場成像原理，能夠在實現軸向400微米范圍的高速三維成像的同時，將激光照射對細胞的損傷降低了數百倍。針對活體組織復雜環境引起的光學像差降低系統成像分辨率與信噪比這一難題，團隊提出了基于波動光學的數字自適應光學架構，無需在光學系統中增加額外波前傳感器或者空間調制器，在后端即可完成大視場多區域自適應光學像差矯正，從而提升大視場復雜環境三維成像的空間分辨率以及信噪比。這一設計使得僅需常規尺寸物鏡，就能有效克服空間非一致的系統像差和樣本像差難題，實現了全視場內均一高空間分辨率的十億像素成像，顯著降低介觀成像系統尺寸與成本，使得高分辨活體介觀顯微成像系統變得更加廣泛可及。除此之外，活體熒光成像中背景熒光嚴重影響了成像信背比，RUSH3D采用多尺度去背景算法實現背景信號和在焦信號的分離，精準濾除散焦背景，從而提升成像信背比，恢復淹沒在熒光背景中的熒光信號。進一步與共聚焦掃描光場融合，將能在具備高通量介觀觀測能力的同時，實現共聚焦成像保真度。
 

圖3.RUSH3D實現大視場與高分辨率兼備的介觀三維成像
 

　　RUSH3D通過其跨時空的多尺度成像能力，極大拓寬了科學家對大腦的認知。大腦皮層的神經元網絡被認為是高等動物神經系統中十分重要而又復雜的信息處理中心，是產生生物智能乃至意識的關鍵神經網絡區域。然而，由于觀測技術限制，目前大部分研究只能同時記錄實驗動物中一個或幾個皮層區域的神經元活動，難以進一步研究皮層神經元網絡的聯合動態變化。通過RUSH3D大視場、三維高分辨率、高幀率的成像優勢，交叉團隊開創性實現了對頭固定下清醒小鼠背側皮層17個腦區中十萬量級大規模神經元的長時間高速三維記錄，并且能夠對同一群神經元進行跨天連續的追蹤。運用該系統，證實了響應感覺刺激，調控運動的神經元并非只存在于單一感覺皮層、運動皮層，而是廣泛存在于皮層各個區域，但各個區域神經元對感覺信息編碼、整合、區分的能力存在差異。進一步發現自發運動行為發起時，小鼠皮層神經元網絡由尾側向鼻側傳導的發放模式。這一結果提示視覺、觸覺等感覺皮層神經元的信息整合和全皮層范圍信號擴散可能是引起自發運動的關鍵因素。在此基礎上，RUSH3D有望首次實現解析全背側皮層的介觀腦功能圖譜，通過捕捉大腦內的成百上千萬神經元間的動態連接與功能，有望能揭示意識的生物學基礎，智能的本質等人類基本問題，推動對神經退行性疾病的研究，并有望推動腦啟發的人工智能發展。
 

圖4.小鼠全腦皮層范圍三維神經成像
 

　　RUSH3D系統為研究大規模細胞交互提供了前所未有的工具。例如，生發中心(Germinal center, GC)是被抗原激活后的B細胞在趨化作用引導下聚集形成的組織結構，對于自身免疫性疾病、疫苗、病毒感染等過程都至關重要。由于受到視場和拍攝時長的限制，免疫細胞如何參與多個GC生成以及如何在多個GC間進行遷移的過程從來沒有被連續記錄過，從而限制了該領域的發展。團隊利用RUSH3D對小鼠腹股溝附近淋巴結在免疫反應85個小時左右進行了長達十數小時的高速三維成像，完整記錄了B細胞參與多個GC生成的過程。與此同時，觀測到在免疫反應145個小時GC已經完全形成之后，一些T細胞在多個GC之間完整遷移的過程，預示了T細胞可能參與了GC之間的信息交流和傳遞。這些對信使T細胞在不同生發中心之間交流信息的觀測有望帶來我們對免疫過程的全新認識。
 

圖5.B淋巴細胞參與小鼠淋巴結多個生發中心形成的完整過程
 

　　跨時空的多尺度成像能力使得RUSH3D極大提升了實驗效率。例如，藥物篩選實驗能夠在單次實驗中顯著提高效率，免去多次試驗需求。同時，由于RUSH3D可以提供足夠數據進行統計分析，跨個體差異可以在一次實驗中得到有效緩解。此外，諸如腫瘤轉移等稀有事件，在RUSH3D的觀察中將不再是偶發事件，而是常規可見現象，成百上千倍地提升了活體生物發現的效率。憑借其低光毒性三維觀測的優勢，該系統還能夠同時觀察到細胞間的長距離通信，并通過長時間追蹤數百萬個細胞，揭示集體細胞行為的物理規律和功能涌現的機制，例如能夠捕捉從腫瘤發生開始到免疫應答、腫瘤生長的全過程，揭示腫瘤產生的完整免疫活化反應。作為RUSH3D在醫學領域的初探，研究人員首次觀測到了急性腦損傷(腦震蕩等)后整個大腦皮層范圍內的中性粒細胞遷移活動。當小鼠的腦部受到撞擊以后，大量的中心粒細胞從血管周邊非血管區域流出進入腦實質，也有極罕見的細胞從腦實質回流到血管里，這意味著有些細胞可能通過類淋巴系統進入腦實質，并且會流回血管中將信息傳遞到生物體的其他地方。通過國際首次捕捉對腦損傷修復過程單細胞水平的免疫反應，有助于開發特定療法避免急性腦損傷后組織水腫帶來的腦功能缺失難題，并為更廣泛的腦疾病等醫學問題提供新視角。
 

圖6.急性腦損傷后全皮層范圍單細胞水平免疫反應
 

　　基于該系列成果的核心專利已于清華大學轉化成立了國產自主先進顯微儀器公司，致力于國產自主可控具備國際領先性能的高端光學顯微鏡以及其在生命科學等領域的前沿應用。已支撐清華、北大、北航、北師大、解放軍總醫院、同濟醫院等國內高水平科研機構，在腫瘤學、免疫學、腦科學等不同領域開展了20余項創新性生命科學研究，服務于生物制藥領域。
 

　　清華大學自動化系博士后張元龍、深圳國際研究生院博士生王鳴瑞和基礎醫學院博士生朱齊禹是本文共同第一作者，清華大學自動化系戴瓊海院士、吳嘉敏副教授，基礎醫學院郭增才副教授為論文共同通訊作者，郭鈺鐸、劉波、李嘉敏、姚嘯、孔垂、張億、黃予超、祁海參與并作出重要貢獻。研究得到國家自然科學基金委、國家科技部重點研發計劃以及清華大學Brain-X項目的大力支持。