由中國材料與試驗標準化委員會科學試驗標準化領域委員會科學試驗創新方法標準化技術委員會(CSTM/FC98/TCO2)歸口承擔的《玉米褪綠斑駁病毒形態學檢測透射電子顯微鏡法》團體標準(立項號:CSTM LX 980200999―2022)已完成征求意見稿，按照《中關村材料試驗技術聯盟團體標準管理辦法》的有關規定，現公開廣泛征求意見。
 

　　玉米褪綠斑駁病毒(Maize chlorotic mottle virus, MCMV)是侵染玉米的重要檢疫性病毒病原，被列入《中華人民共和國進境植物檢疫性有害生物名錄》。該病毒與馬鈴薯Y病毒科(Potyviridae)的幾種病毒之一復合侵染引起的玉米致死壞死病(corn lethal necrosis，CLN)，是玉米生產的毀滅性病害，一旦發生將帶來嚴重的經濟損失。MCMV為直徑30nm的二十面體對稱球狀粒子，可經汁液、介體葉甲和薊馬傳播，田間擴散容易，在病毒分類學上歸屬于類番茄叢矮病毒目(Tolivirales)、番茄叢矮病毒科(Tombusviridae)、玉米褪綠斑駁病毒屬(Machlomovirus)(附錄A)。應用透射電子顯微鏡可觀察其形態結構以及細胞病理學特征，是驗證抗體檢測和分子檢測結果的重要形態學檢測依據。
 

　　透射電鏡為大型精密儀器，技術要求較高，用透射電鏡技術檢測植物病毒雖然廣泛應用于高等院校、科研院所、檢驗檢疫機構，但由于各個電鏡實驗室技術能力的差異，在具體操作上缺少統一標準，往往造成檢測結果差別很大。迄今為止還沒有一個國家或者行業標準可用于規范MCMV的電鏡檢測分析，我們也沒有查到相應的國際標準。因此，有必要先制定一部規范MCMV透射電鏡形態學檢測診斷的團體標準，把關鍵的樣品前處理程序以及電鏡判定標準確定下來，以保證檢測結果的準確性和科學性。
 

　　本文件參照GB/T 1.1―2020 《標準化工作導則 第1部分：標準化文件的結構和起草規則》，GB/T 20001.4《標準編寫規則 第4部分：試驗方法標準》給出的規則起草。參考SN/T 2964-2011 植物病毒檢測規范；SN/T 2122-2015 進出境植物及植物產品檢疫抽樣；GB/T 31810-2015 玉米褪綠斑駁病毒檢疫鑒定方法等規程編制。
 

　　本文件規定了應用透射電子顯微鏡對玉米褪綠斑駁病毒進行形態學檢測的方法。本文件適用于玉米褪綠斑駁病毒的檢驗檢疫與鑒定。
 

　　方法原理：
 

　　負染色技術原理：采用高密度的重金屬鹽染色液(如磷鎢酸、醋酸雙氧鈾等)包圍低密度的樣品顆粒，使樣品顆粒周圍的電子密度得到增強，在透射電鏡下顯示暗背景襯托的淺色樣品顆粒形態及微細結構，圖像呈現負反差。該方法直接對病毒懸液樣品進行負染色，操作簡便，可用于病毒快速檢測。
 

　　免疫電子顯微術原理：免疫電子顯微術分為免疫復合物電鏡技術和免疫標記技術兩大類。免疫復合物電鏡技術是對電鏡載網上形成的抗原抗體免疫反應復合物進行負染色后電鏡觀察，適用于病毒快速檢測診斷。免疫標記技術是以抗體連接標記物(如膠體金)作為探針，對細胞表面或細胞內部的相應抗原進行定位、定性及定量測定。
 

　　超薄切片技術原理：將經過固定的生物樣品樣包埋在樹脂介質中，采用超薄切片機將聚合的樣品包埋塊切成厚度為50 nm~100 nm的薄片，在透射電鏡下觀察細胞內病毒分布及細胞病理變化。
 

　　儀器設備：
 

　　1.透射電子顯微鏡；2.超薄切片機；3.玻璃制刀機；4.超薄切片鉆石刀；5.高速離心機；6.正置光學顯微鏡；7.研缽；8.微型研磨器；9.渦旋振蕩儀；10.輝光放電儀；11.移液器(20μL、200μL)。
 

　　環境條件：
 

　　超薄切片機、透射電鏡應安裝在獨立的房間內，工作環境應符合以下要求：a) 超薄切片機：相對濕度小于60%，溫度(20±5)℃，電源電壓(220±22)V，電源頻率(50±1)Hz，滿足防震要求。
 

　　b) 透射電鏡：相對濕度小于60%，溫度(20±5)℃，電源電壓(220±22)V，電源頻率(50±1)Hz，具備儀器專用地線，接地電阻值參照儀器說明書的要求。
 

　　試驗數據處理：
 

　　MCMV的透射電鏡形態學檢測結果以圖像形式保存，病毒粒子形態與大小尺度符合附錄A和附錄C的特征數據。線粒體的囊泡化及纖維狀內含物、過氧化物酶體外膜周邊小泡等細胞病理學特征為MCMV所特有，可作為形態學檢測診斷依據之一。
 

　　檢測結果發布：
 

　　檢測結果報告應包括以下信息：a)檢測報告的唯一編號；b)樣品名稱；c)送樣人姓名、單位和地址；d)樣品的接收日期；e)檢測儀器及其工作條件；f)檢測結果和必要的說明；g)檢測人簽字；h)檢測報告負責人簽字；i)檢測報告的頁碼；j)發布檢測報告的實驗室名稱和地址；k)檢測報告的日期。
 

　　更多內容詳情請見附件。