【儀表網 儀表研發】植物基因組中有多種多樣的調控元件、功能基序以及非編碼DNA，例如啟動子順式作用元件、miRNA編碼序列、具有調控功能的基因間區。這些DNA序列在調控基因表達、轉錄翻譯等方面發揮重要作用，也是目前基因功能研究與遺傳改良的重點目標區域。基于CRISPR/Cas9的基因組編輯技術已經被廣泛用于功能基因研究和作物遺傳改良。由sgRNA引導的Cas9核酸酶可以在基因組靶位點處產生DNA雙鏈斷裂(DSB)，細胞通過非同源末端連接(NHEJ)修復，往往容易形成1~3個核苷酸的插入或缺失突變。然而，這種插入/缺失突變很難有效地破壞調控DNA的功能，因此經典的CRISPR/Cas9不能有效對上述重要DNA功能元件進行操縱。基于此，開發新型、精準、可預測的多核苷酸刪除基因組編輯系統對調控DNA序列的功能解析及應用具有重要意義。
 

　　中國科學院遺傳與發育生物學研究所高彩霞研究組長期致力于植物基因組編輯新技術的研究和開發。最近，該研究組基于胞嘧啶脫氨以及堿基切除修復(BER)原理，首次將野生型SpCas9與胞嘧啶脫氨酶APOBEC、尿嘧啶糖基化酶(UDG)以及無嘌呤嘧啶位點裂合酶(AP lyase)組合，建立了新型的多核苷酸靶向刪除系統(AFIDs)，并成功在水稻和小麥基因組中實現了精準、可預測的多核苷酸刪除。考慮植物細胞本身存在BER體系，該研究組首先利用高脫氨活性的APOBEC3A脫氨酶構建出3種形式的AFID系統(AFID-1~3)，并在水稻和小麥細胞中對多個內源DNA靶點進行測試，結果顯示AFID-3介導的刪除效率高達33.1%，且產生從不同的5’-胞嘧啶到Cas9切割位點間的多核苷酸刪除，可預測的刪除比例高達30%以上。研究人員進一步對不同胞嘧啶脫氨酶進行篩選，發現截斷的APOBEC3B脫氨酶(A3Bctd)不僅有較高的脫氨活性，同時還具有一個更窄的脫氨窗口。研究人員將A3Bctd替換AFID-3系統中的A3A，從而開發出eAFID-3系統。eAFID-3更高效地介導從偏好TC基序的脫氨位點到Cas9 切割位點之間的可預測刪除，效率是AFID-3的1.5倍。此外，研究組利用AFID-3系統靶向水稻OsSWEET14基因啟動子上的效應子結合元件，獲得了多核苷酸刪除的突變體植株。經白葉枯病接種試驗發現，相較于1~2 bp的插入缺失，該系統產生的多核苷酸刪除水稻突變體對白葉枯病菌的抗性更強。
 

　　AFID系統具有高效、精準、可預測等優勢，因此該系統的建立可為植物基因組調控DNA的功能研究及設計育種提供了一個強有力的基因組編輯工具。該研究成果于6月29日在線發表于Nature Biotechnology上(DOI:10.1038/s41587-020-0566-4)。高彩霞研究組博士后王升星、博士后宗媛、博士生林秋鵬和副研究員張華偉為該論文的共同第一作者，高彩霞為該論文通訊作者。中科院微生物研究所邱金龍研究組也參與了研究工作。該研究得到中科院戰略性先導科技專項、國家轉基因重大科技專項、國家自然科學基金委項目的資助。